Development of novel luminescence-based enzymatic assays for inorganic pyrophosphate and AMP to measure nucleic acid polymerization and ligation, Kyo:n julkaisuja A 77

Jansson Vuokko 10.12.2004\nFarmaseuttinen tiedekunta\nFarmakologia\nDevelopment of novel luminescence-based enzymatic assays for inorganic pyrophosphate and AMP to measure nucleic acid polymerization and ligation (Uusia entsymaattisia menetelmiä nukleiinihappojen polymerisaation ja ligaation mittaamiseen)\nVastaväittäjä: professori Juhani Syväoja, Joensuun yliopisto\nKustos: professori Risto Juvonen, Kuopion yliopisto Väitöskirjan tiivistelmä:\n\nDNA-kaksoiskierteen muodostuminen nukleotideista (polymerisaatio) ja DNA-kaksoiskierteen juosteiden päiden liittyminen toisiinsa (ligaatio) ovat keskeisiä bioreaktioita, joita voidaan hyödyntää seulottaessa uusia lääkeaineita (polymeraasi- ja ligaasiestäjiä) sekä diagnosoitaessa lääkeaineiden tehoon ja turvallisuuteen vaikuttavia yksilön geeniperimän muutoksia. Tämän vuoksi on tärkeää kehittää näiden reaktioiden mittaamiseen yksinkertaisia, nopeita ja edullisia menetelmiä, joissa ei tarvita radioaktiivisia lähtöaineita eikä lopputuotteiden työlästä erottelua reaktioseoksista.\n\nTutkimuksen alussa kehitettiin DNA-polymerisaation mittaamiseksi kvantitatiivinen menetelmä, jossa nukleotidien polymerisoituessa tapahtuva pyrofosfaatin vapautuminen kytkettiin uuteen reaktioon, jonka tuotteena syntyi luminometrisesti ja fluorometrisesti helposti mitattavaa vetyperoksidia. Uusi menetelmä soveltuu DNA-diagnostiikassa yleisesti käytettävän alleelispesifisen polymeraasiketjureaktion kvantitointiin.\n\nSeuraavaksi kehitettiin DNA-ligaation mittaamiseksi kvantitatiivinen menetelmä, jossa DNA-juosteiden liittyessä tapahtuva adenosiinimonofosfaatin (AMP) vapautuminen kytkettiin pitkäkestoisen luminesenssin tuottavaan sykliseen bioreaktioon. Menetelmä mahdollistaa kantajaan kiinnitettyjen renkaan muodostavien DNA-koettimien käytön DNA-diagnostiikassa ja siten aikaisempaa spesifisemmän genotyypitykseen. Lisäksi menetelmä mahdollistaa bakteerispesifisten DNA-ligaasiestäjien tehokkaan seulonnan uusiksi kehitettäviksi antibiooteiksi.\n\nLopuksi kehitettiin menetelmä lääkkeenäkin käytettävän deoksiribonukleaasi I:n ja vastaavien juostekatkoksia tuottavien entsyymien aktiivisuuden ja spesifisyyden kvantitatiiviseen mittaamiseen. Menetelmä perustuu DNA-ligaasientsyymin käyttämiseen juostekatkosten korjauksessa. Ligaatiossa vapautuu AMP:tä, jota voidaan mitata edellä mainitulla pitkäkestoisen luminesenssin tuottavalla bioreaktiolla.\n\nTämä väitöstutkimus tehtiin yritysprojektina vuosina 2000–2004 CSI Biotech Oy:ssä. Tutkimuksen tuloksia on julkaistu kaikkiaan viidessä "Analytical Biochemistry" -aikakauslehdessä ilmestyneessä tieteellisessä artikkelissa. Lisäksi tuloksista on jätetty kolme kansainvälistä patenttihakemusta. Tutkimus liittyy Tekesin rahoittamaan Diagnostiikka-2000 -ohjelmaan.\nKuopion yliopiston julkaisuja A. Farmaseuttiset tieteet. ISBN 951-781-295-7\nKuopion yliopisto\nViestintä\ntiedotus@uku.fi

ISBN-10:
951-781-295-7
Kieli:
eng
Sivumäärä:
82 s.
Tekijät:
Jansson Vuokko(diss)
Tuotekoodi 019950
20,00 €